研究系及び研究施設の現状 249
藤 井 浩（助教授） （1998 年 3 月 1 日着任）
A -1) 専門領域：生物無機化学、磁気共鳴
A -2) 研究課題：
a) 酸化反応に関与する金属酵素反応中間体モデルの合成 b) 亜硝酸還元酵素の反応機構の研究
c) 小分子をプローブとした金属酵素の活性中心の構造と機能の相関 d) 位置特異的ミューテーションを用いた基質配向制御による酵素機能変換
A -3) 研究活動の概略と主な成果
a) 生体内で酸化反応に関与する金属酵素は，その反応中に高酸化状態の反応中間体を生成する。この高酸化状態の 反応中間体は，酵素反応を制御するキーとなる中間体であるが，不安定なため詳細が明らかでない。酸化反応に関 わる金属酵素の機能制御機構を解明するため，高酸化反応中間体のモデル錯体の合成を行った。非ヘム酵素モデ ルとして立体障害を導入した新規サレン鉄錯体を合成した。構造解析や電子構造を研究した結果，カテコールジオ キシゲナーゼの特異な活性中心の構造が，電子的要因によることを明らかにした。
b) 地中のバクテリアの中には，嫌気条件で硝酸イオンを窒素に還元する一連の酵素が存在する。これらの過程で，亜 硝酸イオンを一酸化窒素に還元する過程を担う酵素が亜硝酸還元酵素である。銅イオンを活性中心にもつ本酵素の 反応機構をモデル錯体から研究した。酵素がもつ反応場が酵素機能に果たす役割を解明するため，種々の配位環 境をもつモデル錯体を合成した。モデル錯体の合成と構造解析に成功した。モデル錯体は，配位環境によらず窒素 原子で配位した構造をとることが明らかになった。
c) 金属酵素と強く結合する小分子をプローブとした構造・機能測定法の開発を行った。金属酵素の金属イオンに配位 した小分子は，配位する金属イオンの種類，配位子，構造によりその電子状態を大きく変化させる。この電子状態 の変化を磁気共鳴法により検出し構造や機能との相関を示すことができれば，新規構造・機能測定法になると考え る。ヘムに配位したオキソ原子の
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O N M R の測定を行い，酸化活性との相関を研究した。またヘムに配位したシ アンイオンの
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C NMR や
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N NMR が，ヘム近位側，遠位側の水素結合の特性を知るよい手法であることを示した。 さらに，銅タンパク質と強く結合する一酸化炭素（C O）が
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C u N M R による構造・機能解析のよいプローブにな ることを見出した。
d) 酵素は，高い反応選択性を示すことがよく知られている。酵素の活性中心にある基質結合に関わるアミノ酸残基に 着目し，基質の中で反応させたい部位が活性サイトに来るような酵素を設計し，作成した。この手法に基づき，反 応選択性をもたない特異な酵素を選択性をもつ酵素に変換することに成功した。
B -1) 学術論文
M. KUJIME and H. FUHII, “Spectroscopic Characterization of Reaction Intermediates in Nitrite Reduction of Copper(I)
Nitrite Complex as a Reaction Model for Copper Nitrite Reductase,” Angew. Chem., Int. Ed. 45, 1089–1092 (2006).
A. TANAKA, H. NAKAMURA, Y. SHIRO and H. FUJII, “Roles of the Heme Distal Residues of FixL in O2 Sensing: A Single Convergent Structure of the Heme Moiety Is Relevant to the Down-Regulation of Kinase Activity,” Biochemistry 45, 2515–2523 (2006).
250 研究系及び研究施設の現状
H. FUJII, T. KURAHASHI, T. TOSHA, T. YOSHIMURA and T. KITAGAWA, “17O NMR Study of Oxo Metalloporphyrin Complexes: Correlation with Electronic Structure of M=O Moiety,” J. Inorg. Biochem. 100, 533–541 (2006).
H. FUJII and T. YOSHIDA, “13C and 15N NMR Studies of Iron-Bound Cyanides of Heme Proteins and Related Model Complexes: Sensitive Probe for Detecting Hydrogen Bonding Interactions at the Proximal and Distal Sides,” Inorg. Chem. 45, 6816–6827 (2006).
T. KURAHASHI, K. ODA, M. SUGIMOTO, T. OGURA and H. FUJII, “A Trigonal-Bipyramidal Geometry Induced by
an External Water Ligand in a Sterically Hindered Iron Salen Complex, Related to the Active Site of Protocatechuate 3,4- Dioxygenase,” Inorg. Chem. 45, 7709–7721 (2006).
B -4) 招待講演
藤井 浩 , 「金属酵素の機能発現メカニズムの解明とそれに基づく人工酵素の開発」, 化学と生物の新融合領域のフロントラン ナー , 札幌 , 2006年 2月.
H. FUJII, “Spectroscopic Characterization of Reaction Intermediates in a Model for Copper Nitrite Reductase,” Post Hyaishi Symposium “Chemical Biology of Redoxmetalloenzymes,” Hrima (Japan), April 2006.
藤井 浩 , 「立体障害を導入した新規サレン錯体による単核非ヘム酵素の構造と機能の研究」, 分子研研究会「金属機能中心 を持つ高性能分子システムの創成—その構造と機能」, 岡崎 , 2006年 6月.
H. FUJII, “Control of Regioselectivity of Heme Oyxgenase by Reconstruction of Hydrogen-Bonding Interactions between Substrate and Enzyme,” 5th East Asia Biophysics Symposium, Okinawa (Japan), November 2006.
B -10)外部獲得資金
奨励研究 (A ), 「ヘム酵素の軸配位子が多様な酵素機能を制御する機構の解明」, 藤井 浩 (1997年 -1999年 ).
重点領域研究（公募）「生体金属分子科学」, 「チトクロームｃ酸化酵素反応中間体モデル錯体の構築と反応機構の研究」, 藤 井 浩 (1997年 -1998年 ).
上原記念生命科学財団 研究奨励金 , 「ヘムオキシゲナーゼにおける反応特異性およびヘム代謝機構の研究」, 藤井 浩 (1999年 ).
重点領域研究（公募）「生体金属分子科学」, 「17O-NMR による銅－酸素錯体の配位した酸素の電子構造と反応性の研究」, 藤 井 浩 (1999年 ).
内藤財団 科学奨励金 , 「ヘムオキシゲナーゼによる位置特異的ヘム代謝機構の解明」, 藤井 浩 (2000 年 ).
基盤研究 ( C ) , 「合成ヘムとミオグロビン変異体による亜硝酸還元酵素モデルの構築と反応機構の研究」, 藤井 浩 (2000 年 -2002 年 ).
基盤研究 (B), 「単核非ヘム酵素反応中間体としての高酸化オキソ錯体の合成と反応性の研究」, 藤井 浩 (2002 年 -2004年 ). 基盤研究 (B), 「立体構造にもとづく基質結合サイトの再構築による酵素反応選択性の制御」, 藤井 浩 (2004年 -2007年 ). 大幸財団 海外学術交流助成金 , 「第３回ポルフィリンとフタロシアニンに関する国際会議での研究発表」, 藤井 浩 (2004 年 ).
特定領域研究（公募）「配位空間」「金属酵素のナノ反応空間における基質の配向およ, び反応選択性の制御」, 藤井 浩 (2005 年 -2006年 ).
研究系及び研究施設の現状 251 C ) 研究活動の課題と展望
生体内の金属酵素の構造と機能の関わりを，酵素反応中間体の電子構造から研究している。金属酵素の機能をより深く理解 するためには，反応中間体の電子状態だけでなく，それを取り囲むタンパク質の反応場の機能を解明することも重要であると 考える。これまでの基礎研究で取得した知見や手法をさらに発展させて，酵素，タンパクのつくる反応場の特質と反応性の 関係を解明していきたいと考える。また，これらの研究を通して得られた知見を基に，酵素機能変換法の新概念を確立できる よう研究を進めたいと考える。
